New York の地下鉄に住む微生物のお話．
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以下のアドベントカレンダー用の記事になります．
今回は以下の論文を読みました！
https://www.cell.com/fulltext/S2405-4712(15)00002-2
タイトル：
Geospatial Resolution of Human and Bacterial Diversity with City-Scale Metagenomics
著者：
Ebrahim Afshinnekoo, Cem Meydan, Shanin Chowdhury, Jane M. Carlton, Shawn Levy, Christopher E. Mason
忙しい人のための論文ハイライト：
・地下鉄の表面に存在するすべてのDNAのうち，半分は未知の生物でした．
・数百種の細菌が地下鉄に存在しており殆どが無害です．より多くの地下鉄の利用者がより多くの多様性をもたらします．
・ハリケーン・サンディの影響で洪水が起きた1つの駅は，依然として細菌群集が海洋環境に似ています．
・採取したDNAのうちヒトの対立遺伝子は，アメリカの人口統計データを反映していました．
背景：
微生物は，様々な環境に存在しておりヒトの健康や疾病において不可欠な要素になっています．世界の人口の54% が都市部に住んでおり，空気に焦点を当てて大都市圏の環境シーケンスが行われています．ニューヨーク市(以下：NYC)は，アメリカ最大かつ人口が高密度であるため，大規模なメタゲノム研究を実施するのに理想的な地域です．NYC地下鉄年間17億人が利用する世界最大の大量輸送システムです（これは駅数的なお話で，駅あたりの利用人口は日本がぶっちぎりです）．この広大な都市の生態系はバイオテロリズム，環境破壊，疾病の拡大などから保護されるべきです．本研究では，NYC地下鉄における微生物などをはじめとするDNAを調査し，潜在的なバイオ驚異を特定し，スマートな都市づくりを実現するための第一歩と位置づけられています．
A: NYCの5つの区域をマンハッタン，ブルックリン，クイーンズ，ブロンクス，スタテン・アイランドにわけています．
B: NYC地下鉄24路線466箇所から3分間綿棒でこすってサンプリングし，メタデータを入力し，GPS-tag, タイムスタンプをプロットしています．
C: 実験・解析のワークフローを示しています．
D: 採取されたサンプル全体から同定された分類群の分布を示しています．
E: 一般的に見られるPseudomonas 属の高密度な場所を示しています．
結果:
Fig1D にあるように配列の約半数（48.3%）が既知の生物と一致しないことを発見しました．配列の大部分は細菌（46.9%），続いて真核生物（0.8%），ウイルス（0.03%），古細菌（0.003%）およびプラスミド（0.001%）でした．Table1 のように，NYC地下鉄に最も多く存在している細菌種はPseudomonas stutzeri であり，マンハッタン南部に高密度に存在し，続いてEnterobacter, Stenotrophomonas からの細菌株が豊富に存在していました．
交通量の多い地域や接触の高い地域からのサンプリングにかかわらず，BWAを使用して平均0.2%しかヒトゲノムにマッピングされていないことがわかりました．本研究では，2010年のアメリカ人口統計データ（http://demographics.coopercenter.org）を使用してサンプリングデータがGPS座標で示された地域とその地域の人口統計データを比較しています．
1000 Genomes Projectと祖先予測をしてくれるAncestryMapperを用いて，高精度の人口統計を再現できました．BおよびCでは人口統計データと一致するアフリカの対立遺伝子の増加が予測され，ブロンクス（Mount Eden）の主なヒスパニック地域でも同様の傾向が観察されました．
次に，今回のサンプル（Fig1C）で同定された細菌の組成を調べたところ，NYC地下鉄に見られる細菌の大部分（57%）がヒトの疾患に関連していないことがわかりました．種レベルで検出された分類群のうち12%がYersinia pestis (ペスト菌)およびBacillus anthracis (炭疽菌)のゲノムに一致する断片を含む既知の病原菌でした．これらの分類学的割り当てをさらに詳しく調べるために，BLASTとMetaPhlAn によって検出された種のみを，疾病管理センター（CDC）およびPathosystems Resource Integration Center (PATRIC) の既知の病原リストと比較しました．そうしたところ，大腸菌の大部分の系統は良性であり，これらの配列がBLASTとMetaPhlAnの分類学的割り当てによって注釈された微生物由来ではないことがわかりました．
生きた微生物が地下鉄の駅から培養できるかどうかを調べるために2つの実験を行いました． 地下鉄のサンプルを4種類のLB寒天培地に移し，生存可能な細菌を確認しました (Fig4A)．培地の種類は，コントロール１つ，抗生物質３つ（カナマイシン，クロラムフェニコール，アンピシリン）です．同じ駅から採取した微生物を試験すると，28%は抗生物質耐性コロニーを生じました．地下鉄の細菌には多くの生きている細菌群集が存在することと同時に，それらの一部が一般的に使用される抗生物質に対する耐性を持っているということも示しています．
A: 1つのコロニーを4枚の培地にまき，カナマイシン，クロラムフェニコール，アンピシリンの3つの抗生物質について試験しました．2つの抗生物質に体制があり，抗生物質の存在下でさえも増殖を示した5つのプレート（ピンク丸）を見出しました．
B: スワブとLB培地およびTSA培地から培養し配列決定され見つかった種数．
C: テトラサイクリン耐性遺伝子のカバレッジを元のサンプルに対する Tet + サンプルの比として計算しlog2比をヒートマップとしてプロットしています．
D: 培養したそれぞれのサンプルにおける各tet遺伝子のカバレッジの分布は，tetX遺伝子上で収束していました．
交通量の多い駅（グランドセントラル駅，タイムズスクエア駅）が最も群集の多様性が高いことがわかりました（Fig4B）．また，TSA培地，LB培地を用いてテトラサイクリン耐性遺伝子を29種観察し，テトラサイクリン処理前後のサンプルにおけるこれらの遺伝子のそれぞれのカバレッジを比較しています（Fig4C）．両方の培地において最も有意に増加した耐性遺伝子tetK が存在しており，他のすべての遺伝子（t検定，p = 0.003）と比べて有意に多いことがわかりました（Fig4D）．この遺伝子はテトラサイクリン耐性表現系の既知の遺伝的要因であると知られています．
地下鉄表面に生息する微生物を詳細に知るために，Human Microbiome Project (HMP) のアノテーションを用いました．NYC地下鉄のデータは，皮膚，腸内，ひ尿生殖路に関連していることがわかりました（Fig5A）．
A: HMPデータと一致した67種のPathoMap種のうち，皮膚，腸管，ひ尿生殖路の割合が最も高かったです．
B: HMPのデータベースに登録されっているサンプル比率を考慮し，観測された種数と予測された種数のlog2を計算し皮膚で高頻度に観測される細菌がNYC地下鉄で最も優勢な細菌であることが示されました．
C: 地域ごとに見つかった種数の箱ひげ図です．
D,E: Enterococcus faecium およびStaphylococcus aureus の密度を示すNYCのヒートマップ．小さな赤い点は，mecA遺伝子の存在を示しています．
F: ハリケーン・サンディ中に浸水した地下鉄駅の分析です．10種のユニークな細菌がいました．
微生物群集の持続性を計測するため，平日の1時間に3回Penn 駅のサンプリングを行い分析しました．Pseudomonadaceae，Enterococcaceae およびMoraxellaceae のような特定の分類群があらゆるタイムポイントで多く見られていることを明らかにしました（Fig6A）．また，1日の間に特定の属において高度の変動が観察されました．Pseudomadaceae は11:00~13:00の間に最大の豊富さを示し，Moraxellaceae は17:00に最大になっていました．
1時間毎にPenn 駅で採取されたサンプルの分析結果．
A: 特定の時間における存在割合に対する分類群の比例分布．各線の太さは検出された分類群の数に線形に比例しています．
B: 各タイムポイントにおける細菌分類群（属レベル）の割合．最大種数（n = 64）は13:00に，最小値（n = 51）は11:00になっており，プロットの幅に比例しています．
これらのデータをMTAデータと8時間単位で比較したところ，駅の利用者の増加に対応して，日中に収集されたDNA量が増加することもわかりました．しかしこれらの傾向はどれも細菌の多様性とは有意に関連していませんでした（Fig6）．
議論：
以前のメタゲノム研究は対象地域に焦点を当てていましたが，本研究では都市規模でのヒトと微生物の多様性の分布を明らかにしました．そのようなデータは，正常な細菌群集と潜在的な病原体のベースラインを定義しているため，健康の観察と潜在的な疾病の検出に重要なデータです．これらのデータはNYC地下鉄が安全であると示しています．
最近の研究で，家庭の微生物群集は家族によって特定の群集組成を示し，個人とともに移動することが示されています．しかし，地下鉄のような大量輸送システムの場合，細菌群集の組成は具体的に明らかになっていませんでした．これらのデータはハリケーンのような洪水現象などが地下鉄駅に長期で影響を与える可能性があることを示しています．
Penn 駅での時間帯による細菌群集の変化は，毎時でさえ通勤者の周りを絶えず移動している膨大な細菌の生態系が存在していることを示しています．
理想的には，これらのデータを大量輸送システムにおいて微生物の動向を監視するために利用できそうです．しかし，これを実現するためには参照するデータベースが拡大すること，データの意味付けを助けるための他の都市における微生物プロファイルも必要になってきます．最後に，さらに高速にリアルタイムに，都市のメタゲノムと大量輸送システムの特徴づけがあらゆるシステムの摂動に対する応答速度を更に軽快にすることができ，数百万人の人びとの生活に影響を与える可能性があります．
【トレンドをつかむ!?】建造物の微生物研究のまとめ
今回は，世界の都市環境の微生物研究のトレンドを追うため，Nature に投稿された最新のレビューを読んでいきたいと思います．
論文は以下のリンクから閲覧できます．
https://www.nature.com/articles/s41579-018-0065-5
題名: Microbiology of the built environment
著者: Jack A Gilbert and Brent Stephens
要旨：
建造された環境は，私達の家庭，職場，学校，輸送システムを含む人工的なすべての構造を含みます．地球上の生態系のように，建造物環境における空気中，表面上および建築材料にはあらゆる微生物が存在しており，それらは通常ヒトや動物および屋外源によって分散されています．これらの微生物群およびそれらの代謝産物が，ヒト疾患を引き起こす（または，悪化させる）こと，および予防する（または緩和する）ことが暗示されています．本レビューでは，建造環境の微生物学の歴史を概説し，最新の研究について紹介し議論します．
まえがき：
人びとは，多くの時間を建造物（建物，輸送システムなど）で過ごしています．地球上で見られる他の環境の微生物群とは異なる微生物コミュニティが存在しています．私達は多くの種類の微生物を建造環境内で見つけることができますが，それらの人間への健康への影響はあきらかになっていません．彼らは活発に生育しているのか，病気を促進することができるのか，病気から私達を守ることができるのか，有害な微生物だけを駆除しながら有益な微生物を利用できるか，どのようにして建造物環境を最適化できるのか，多くの疑問があります．
建造環境の生態：
初めて配列ベースの細菌群集の屋内環境調査が行われたのが2004年です．そこからの１０年は様々な建造環境における微生物の群集構造パターン，それらを促す因子の推定，空間間の微生物群集の類似点・相違点を調査するものでした．そして，それらの多くがヒトの皮膚および口腔内に由来する微生物であると明らかになっています．
病院，交通機関および農家の細菌多様性をカタログ化することにより，共通の細菌（Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp.）の存在が明らかになりました．また，農家ではヒトおよび動物における共通の腸内細菌であるRuminococcus spp. が検出されました．病院の環境では，Pseudomonas spp. のような一般的な潜在的病原体を含むヒト関連微生物が検出されています．
微生物の分類学的な特徴づけを超えて，さらなる研究をするためには各微生物の遺伝情報（すなわち全ゲノム）を配列化することが必要です．2008年には，シンガポールにおける２つのショッピングモールから室内空気をサンプリングし，ショットガンメタゲノム配列決定を適用した論文が出ており，空気中の微生物群集がショッピングモール内にいる人びとによって供給されており，そこには潜在的な病原体であるBrucella，Bordetella，Mycobacterium が含まれていることが明らかになっています．またニューヨークで行われた研究では，ニューヨーク市の屋外空気にはβラクタマーゼとテトラサイクリン耐性遺伝子が豊富に存在していました．
微生物と宿主の相互作用：
ヒトやペットなどの居住者は，空気やさまざまな建造物表面との広範な微生物相互作用を有しています．これらの相互作用は病原体との伝達について着目され多く研究されてきました．Bacillus anthracis，Legionella pneumophilaやMycobacterium tuberculosis などの細菌性の病原体，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum およびAspergillus fumigatus などの真菌病原体，インフルエンザなどの病原性ウイルスが挙げられます．
居住者と建造環境間の微生物伝達は相反しています．ヒトの病原体が空気や表面を経由して伝搬される可能性を理解することが重要視されています．黄色ブドウ球菌，緑膿菌，ノロウイルスやインフルエンザウイルスなど，多くの微生物が表面接触を介してヒトへ伝達できます．基本的に，良性の微生物より病原体のほうが詳細に研究されています．
建造物とヒトの健康における微生物学は，微生物の見方を否定的な役割（病原性，感染性など）から潜在的なポジティブな役割（予防的，緩和的など）に変わってきています．屋内微生物が健康へ与える影響を調べる研究の殆どが，呼吸器疾疾患および皮膚疾患に対する真菌類および他のアレルゲンの悪影響の程度について焦点を当ててきました．ヒトは１日に16,000 L もの空気を 吸い込みます．したがって，微生物暴露を促進するヒトと建造環境の相互作用がヒトの健康に大きな影響を及ぼすのには理由があります．
屋内微生物代謝：
直接感染に加えて，ヒトの健康に関わる微生物暴露の影響に関する主な懸念の１つ として微生物代謝の影響が挙げられます．室内の湿気，カビ臭などです．細菌・真菌の毒素，細胞壁のアレルギー成分および 微生物由来揮発性有機化合物（MVOCs） は屋内の湿気とヒトの健康影響の間に関連性が認められてはいるものの，決定的な証拠にはなりえていません．いくつかの研究では，MVOCs が湿気の多い建造物に富んでいることが示されており，MVOCは微生物増殖のための栄養的および構造的基質として機能することを明らかにしています．近年のメタボロミクス技術の進歩により，MVOCが植物または建築材料にに由来するかどうかについての混乱が解決されています．
建造環境での微生物代謝に関する私達の知識の大半は，in vitro での室内微生物単離物の研究から来ています．しかしながら，微生物代謝活性に対する水分及び他の環境変数の影響を決定するために多くの研究が試みられています．ハウスダストの研究は，この粒子状物質内の微生物の水分依存性代謝活性の証拠を提供しています．ホコリは豊富な混合物であり微生物の増殖のために必要な基質を提供しています．
a: 屋内の空気と表面には，ホコリや微生物の化学物質が付着しています．環境中の相対湿度の増加は，粉塵及び表面の微生物代謝産物の量を増加させます．室内湿気及びカビは多くの異なる疾患に関連していますが，微生物の代謝物と疾患の関連付けは未だとらえどころのないままです．
b: 菌類及び細菌の胞子または休眠細胞の発芽は，水分にさらされるとhydrocarbons, amines, terpenes, alcohols, aldehydes, ketones や sulfuricを含む代謝産物の増加をもたらします．
微生物適応：
建造物の物理的および化学的特性および建造環境における微生物が遭遇する表面材質は，大部分が自然環境における材料及び表面と比較して非常に異なります．木星の表面でさえも，状態を保存するための化学物質でコーティングされています．石膏，ファイバーボード，乾式壁，合成カーペット，その他の独自のカーボンやポリマーは他とは違った生態系を作り出します．ゲノムシーケンス以前の培養法でも表面の材質，物理的構造が異なると異なる生物の増殖を促進することが実証されています．例えば，患者への抗生物質投与から生じる抗生物質の選択圧と組み合わせたカテーテルチューブ上のバイオフィルムの付着及び形成は，これらの材質表面に関連するバイオフィルム内の抗生物質耐性遺伝子の取得につながる可能性があります．
メタゲノミクス配列決定法を用いて，共通祖先を再構成し，適応に必要な機能的属性を形成し，ヒトの健康に関連する選択圧を探索することが可能です．病院環境に関連した細菌遺伝子型は，抗生物質耐性および病原性遺伝子を経時的に獲得するようですが，この傾向は抗生物質投与と統計的に有意に関連はしていませんでした．
含意と翻訳：
屋内環境の微生物群集の生態学，代謝，伝達経路がダイナミックであるという治験は，ヘルスケアの実践方法の改善，建造物の設計などさまざまな観点において関心が高まっています．一例として，子供の喘息発症に影響を与える家庭内の微生物の種類と発生源の特定，病原性ウイルスや最近の伝染を減少させるための表面物質の変更，水分活性の制御によるカビの防止などです．また，法医学では犯罪現場での加害者が残した微生物群集を証拠として使用できるかどうか検討しています．
屋内の微生物を検出できるセンサは微生物または微生物の抗原が病気の発症または予防に関連しているかどうかを理解する上で重要です．病気に関連する代謝物および生物の影響を最小限に抑えつつ，健康を促進する可能性のある微生物暴露を促進するには，換気の増加による屋外空気の割合の増加，使用される建築材料のタイプの変更と，湿気を減らすことが挙げられます．ペット及び植物によって簡単に屋内環境の微生物の多様性は増加できます．農家などは効果的にこれらができると示されていますが，根本的なメカニズムについては多くの考察が必要です．
ヒトの健康を操作するための手段は，環境微生物と代謝物へのヒトの暴露を変えることです．重要であるのは，ヒトの微生物群集を直接操作するわけではなく，ヒトの免疫系に影響を与えうる絶妙なアプローチであると提唱されています．ヒトの健康を促進する免疫反応の刺激をどのようにターゲットするのかを理解することが重要です．絶妙なパラメータ（微生物，代謝物，人口密度，地理的要因，湿気，建材）を正確に操作して，ヒトの健康を促進することはまだできていません．
建造物環境内での正確なリアルタイム微生物センサーの開発が必要とされています．空気中の微生物を検出できるセンサーは，微生物やその抗原が病気の発症または予防に関連しているか明らかにするために重要です．
結論：
建造環境における微生物の研究はまだ非常に初期の分野です．世界中の民間の財団と政府から多くの投資を受けているにもかかわらずです．建造環境の複雑さのために，ヒトの健康及び疾患に直接的または間接的に影響を与える微生物を特定することは困難でした．しかし，微生物の暴露が病気の発症および悪化に影響を与えるという重要かつ魅力的な証拠があります．さらに，微生物暴露が健康に有益な影響を及ぼす可能性があるという証拠は，微生物暴露を改善するために室内環境を操作する方法に関心を集めています．私たちは過去数百年を微生物の感染を防ぐための環境を作ろうと，微生物を敵対視していました．建造環境内の微生物の生態と進化を理解するためには，この分野への継続的な投資が不可欠です．
